线粒体释放细胞凋亡因子的机理研究

【摘要】细胞凋亡对多细胞生物的发育以及组织的稳态十分重要。细胞凋亡有两个已知的通路：一是外源性凋亡通路,一是内源性通路,又称线粒体通路。在线粒体细胞凋亡通路中,线粒体发生一系列变化,包括细胞色素c和SMAC等促凋亡蛋白从线粒体释放至细胞质,线粒体碎片化以及线粒体功能损伤等。虽然过去人们对凋亡的研究取得了惊人的进展,但是以上凋亡时线粒体上的事件的发生机制仍然不清楚。在这些凋亡时线粒体的变化中,细胞色素c的释放是最重要并且研究最详尽的一个。Bax/Bak的寡聚化和OPA1复合体的解体是已报道的两个调控细胞色素c释放的过程。它们分别通过介导线粒体外膜的通透化或者线粒体嵴的重排来实现其功能。然而它们对于细胞色素c释放的重要性以及它们之间的联系还存在争议。这里我们通过利用诱导表达tBid或者Bim的细胞体系作为一个线粒体细胞凋亡的模型,发现线粒体金属蛋白酶OMA1是线粒体细胞凋亡通路中的一个关键调控因子。沉默或敲除OMA1后阻止了Bim/tBid诱导的OPA1切割,OPA1复合体解体,细胞色素c和SMAC的释放,线粒体碎片化,线粒体嵴的重排,细胞呼吸速率的减弱以及细胞死亡。沉默OPA1或者重新表达野生型OMA1而非其蛋白酶失活突变体OMA1H331A可以恢复OMA1稳定沉默细胞的Bim诱导的细胞凋亡表型。因此OMA1的促凋亡功能依赖于其蛋白酶活性以及OPA1蛋白。当细胞发生线粒体凋亡时,OMA1切割OPA1,导致OPA1复合体解体,这进一步导致细胞色素c和SMAC释放,线粒体碎片化和线粒体功能损伤。在健康细胞中,OMA1自我切割形成一个约40KD的蛋白S-OMA1,它是蛋白酶活性形式并且保持着一个基本的活性。当有凋亡刺激或者其它线粒体胁迫处理时,60KD的全长蛋白可以被稳定,而S-OMA1进一步激活,切割其本身及其它底物如OPA1。同时降低Bax和Bak水平显著抑制OMA1激活,OPA1切割以及OPA1复合体解体。并且同时降低Bax和Bak水平可以抑制Bim诱导的线粒体膜电位的丧失以及线粒体ADP刺激的呼吸,而降低OMA1水平不能。此外,降低OMA1水平不能抑制Bim/tBid诱导的Bax/Bak寡聚化。线粒体膜电位的丧失是一个已知的可以诱导OMA1激活的刺激。因此,在细胞凋亡中,OMA1的激活位于Bax/Bak的下游,并且很可能由依赖于Bax/Bak的线粒体膜电位的丧失所引发。总之,我们的结果确定OMA1是线粒体细胞凋亡的中枢调控蛋白。OMA1的激活以及Bax/Bak介导的线粒体膜电位丧失的具体分子机制是今后十分有趣的研究课题。与此同时,我们还开展了寻找tBid/Bim诱导的细胞凋亡的小分子抑制剂的高通量化合物筛选。我们挑出了8个细胞凋亡的有效抑制剂,并且细致地研究了其中的4个：化合物#11,#12,#13和#18。这四个化合物可以抑制tBid/Bim诱导的细胞色素c的释放,但不抑制SMAC的释放以及线粒体的碎片化。#11和#12能够进一步抑制凋亡时OPA1复合体的解体。但这4个化合物都不能抑制Bax/Bak的寡聚化。降低OPA1水平可以削弱化合物#11和#12的活性。这提示OPA1或者其相互作用蛋白可能是化合物#11和#12的靶点之一。这些化合物有可能为治疗细胞凋亡过多引起的疾病提供新的候选药物,并且发现他们的功能性靶点可以为线粒体凋亡的调控提供新的见解,同时也为人们提供新的药物靶点。
【作者】蒋显；
【导师】王晓东；
【作者基本信息】北京协和医学院，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】线粒体细胞凋亡；OMA1；OPA1；细胞色素c释放；

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